Малые рнк и рак. Обо всех рнк на свете, больших и малых Распространение и эволюция пиРНК

Как полагают ученые, неверная экспрессия малых РНК служит одной из причин целого ряда заболеваний, очень серьезно влияющих на здоровье множества людей во всем мире. В числе таких заболеваний - сердечно-сосудистые 23 и онкологические 24 . Что касается последних, то это неудивительно: рак свидетельствует об аномалиях в развитии клеток и в их судьбе, а малые РНК играют важнейшую роль в соответствующих процессах. Вот один из весьма показательных примеров огромного влияния, которое малые РНК оказывают на организм при онкологических заболеваниях. Речь идет о злокачественной опухоли, для которой характерна неверная экспрессия тех генов, которые действуют в период первоначального развития организма, а не в постнатальный период. Это разновидность детской опухоли мозга, обычно появляющаяся еще до двухлетнего возраста. Увы, это очень агрессивная форма рака, и прогноз здесь неблагоприятен даже при интенсивном лечении . Онкологический процесс развивается вследствие неправильного перераспределения генетического материала в клетках мозга. Промотор, который обычно вызывает сильную экспрессию одного из генов, кодирующих белки, претерпевает рекомбинацию с определенным кластером малых РНК. Затем весь этот перестроенный участок проходит амплификацию: иными словами, создается множество его копий в геноме. А следовательно, малые РНК, расположенные «ниже по течению», чем перемещенный промотор, экспрессируются гораздо сильнее, чем следует. Уровень содержания активных малых РНК при этом примерно в 150-1000 раз выше нормы.

Рис. 18.3. Малые РНК, активированные алкоголем, могут соединяться с информационными РНК, не влияющими на устойчивость организма к воздействию алкоголя. Но эти малые РНК не соединяются с молекулами информационной РНК, способствующими такой устойчивости. Это приводит к относительному преобладанию доли молекул информационной РНК, кодирующих вариации белка, связанные с устойчивостью к алкоголю.

Данный кластер кодирует более 40 различных малых РНК. Собственно, это вообще самый крупный из подобных кластеров, имеющихся у приматов. Обычно он экспрессируется лишь на ранней стадии человеческого развития, в первые 8 недель жизни эмбриона. Сильная активация его в мозгу младенца приводит к катастрофическому воздействию на генетическую экспрессию. Одно из последствий - экспрессия эпигенетического белка, добавляющего модификации к ДНК. Это приводит к широкомасштабным изменениям во всей картине метилирования ДНК, а значит, и к аномальной экспрессии всевозможных генов, многие из которых должны экспрессироваться, лишь когда незрелые клетки мозга делятся в ходе ранних этапов развития организма. Так в клетках младенца и запускается раковая программа 25 .

Подобное общение между малыми РНК и эпигенетической аппаратурой клетки может оказывать существенное влияние и на другие ситуации, когда в клетках развивается предрасположенность к раку. Данный механизм, вероятно, приводит к тому, что воздействие нарушения экспрессии малых РНК усиливается путем изменения эпигенетических модификаций, которые передаются дочерним клеткам от материнской. Так может складываться схема потенциально опасных изменений в характере экспрессии генов.

Пока ученые разобрались не во всех этапах взаимодействия малых РНК с эпигенетическими процессами, но кое-какие намеки на особенности происходящего все-таки удается получить. К примеру, выяснилось, что определенный класс малых РНК, усиливающий агрессивность рака груди, таргетирует в информационных РНК определенные ферменты, удаляющие ключевые эпигенетические модификации. Это изменяет картину эпигенетических модификаций в раковой клетке и еще больше нарушает генетическую экспрессию 26 .

Многие формы рака отслеживать у пациента довольно трудно. Онкологические процессы могут идти в труднодоступных местах, что осложняет процедуру отбора проб. В таких случаях врачу нелегко следить за развитием ракового процесса и реакцией на лечение. Часто медики вынуждены полагаться на косвенные измерения - скажем, на томографическое сканирование опухоли. Некоторые исследователи полагают, что молекулы малых РНК могли бы помочь создать новую методику наблюдения за развитием опухоли, позволяющую также изучать ее происхождение. Когда раковые клетки погибают, при разрыве клетки ее покидают малые РНК. Эти небольшие мусорные молекулы часто образуют комплексы с клеточными белками или же завертываются во фрагменты клеточных мембран. Благодаря этому они очень стабильны в жидких средах организма, а значит, такие РНК можно выделить и проанализировать. Поскольку их количества невелики, исследователи вынуждены будут использовать весьма чувствительные методы анализа. Впрочем, тут нет ничего невозможного: чувствительность секвенирования нуклеиновых кислот постоянно повышается 27 . Опубликованы данные, подтверждающие перспективность такого подхода применительно к раку груди 28 , раку яичников 29 и ряду других онкологических заболеваний. Анализ малых циркулирующих РНК у больных раком легких показал, что эти РНК помогают провести различие между пациентами с одиночным легочным узелком (не требующие терапии) и пациентами, у которых образуются злокачественные узелки-опухоли (требующие лечения) 30 .

Разрушение целевой мРНК может происходить также под действием малых интерферирующих РНК (Small interfering RNA, siRNA). Интерференция РНК - одно из новых революционных открытий в молекулярной биологии, а его авторы в 2002 г получили за него Нобелевскую премию. Интерферирующие РНКрезко отличаются по строению от других типов РНК и представляют собой две комплиментарные молекулы РНК длиной примерно в 21-28 азотистых основа­ний, которые соединены друг с другом как нити в молекуле ДНК. При этом по краям каждой из цепей siRNA всегда остается два неспаренных нуклеотида. Воздействие осуществляется следующим образом. Когда молекула siRNA оказыва­ется внутри клетки, она на первом этапе связывается в комплекс с двумя внутриклеточными ферментами - хеликазой и нуклеазой. Этот комплекс получил название RISC (R NA-i nduced s ilencing c omplex; silence - англ. молчать, замолкать; silencing - замолкание, так в англоязычной и специальной литературе называют процесс "выключения" гена). Далее хеликаза расплетает и разъединяет нити siRNA, и одна из нитей (антисмысловая по строению) в комплексе с нуклеазой специфически взаимо­действует с комплементарным (строго соответствующим ей) участком целевой мРНК, что позволяет нуклеазе разрезать ее на две части. Разрезанные участки мРНК далее подвергаются действию других клеточных РНК-нуклеаз, которые доразрезают их на более мелкие куски.

Обнаруженные у растений и низших животных организмов (насекомые) siRNA являются важным звеном своеобразного "внутриклеточного иммунитета ", позволяющего распознавать и быстро уничтожать чужеродную РНК. В том случае, если в клетку проник РНК - содержащий вирус, такая система защиты не даст ему размножиться. Если же вирус содержит ДНК, система siRNA будет мешать ему производить вирусные белки (так как необходимая для этого мРНК будет распознаваться и разрезаться), и с помощью этой стратегии замедлит его распространение по организму. Установлено, что система siRNA отличается чрезвычайной разборчивостью: каждая siRNA будет распознавать и уничтожать только свою, специфическую мРНК. Замена всего лишь одного нуклеотида внутри siRNA ведет к резкому снижению эффекта интерференции. Ни один из блокаторов генов, известных до сих пор, не обладает такой исключительной специфичностью по отношению к своему гену-мишени.

В настоящее время этот метод используется в основном в научных исследованиях для выявления функций различных клеточных белков. Однако потенциально он так же может быть использован и для создания лекарственных препаратов.

Открытие РНК-интерференции дало новую надежду в борьбе со СПИДом и онкологическими заболеваниями. Возможно, применяя терапию siRNA вместе с традиционной антивирусной и противораковой терапией, можно достичь эффекта потенцирования, когда два воздействия приводят к более выраженному лечебному эффекту, чем простая сумма каждого из них, применяемого по отдельности.

Для того, чтобы использовать механизм siRNA - интерференции в клетках млекопитающих для терапевтических целей, внутрь клеток нужно ввести уже готовые двухцепочечные молекулы siRNA. Однако существует целый ряд проблем, которые в настоящее время не позволяют осуществить это на практике, а тем более создать какие то лекарственные формы. Во-первых, в крови на них действует первый эшелон защиты организма, ферменты - нуклеазы , которые разрезают потенциально опасные и необычные для нашего организма двойные цепочки РНК. Во-вторых, несмотря на свое название, малые РНК все же достаточно длинны, а, главное, они несут отрицательный электростатический заряд, что делает невозможным их пассивное проникновение в клетку. И в - третьих, один из самых главных вопросов состоит в том, как заставить siRNA работать (или проникать) только в определенных ("больных") клетках, не затронув при этом здоровых? И, наконец проблема размера. Оптимальный размер таких синтетических siRNA те же 21-28 нуклеотидов. Если увеличить ее длину - клетки ответят выработкой интерферона и снижением синтеза белка. С другой стороны, если попытаться применять siRNA меньшие, чем 21 нуклеотид, резко снижается специфичность ее связывания с нужной мРНК и способность к формированию комплекса RISC. Следует отметить, что преодоление этих проблем критически важно не только для терапии siRNA, но и для генной терапии вообще.

В их решении уже сейчас достигнут некоторый прогресс. Например, ученые пытаются путем химических модификаций сделать молекулы siRNA более липофильными , то есть способными растворяться в жирах, из которых состоит клеточная мембрана, и таким путем облегчить проникновение siRNA внутрь клетки. А чтобы обеспечить специфичность работы внутри только лишь определенных тканей, генные инженеры включают в состав своих конструкций специальные регуляторные участки, которые активизируются и запускают считывание информации, заключенной в подобной конструкции (а значит, и siRNA, если она туда включена), только в клетках определенных тканей.

Так исследователи из Медицинской Школы в Сан-Диего при Калифорнийском Университете (University of California, San Diego School of Medicine) разработали новую эффективную систему доставки малых интерферирующих РНК (siRNA), подавляющих продукцию определенных белков, в клетки. Эта система должна стать основой технологии специфической доставки лекарственных препаратов в различные типы раковых опухолей. «Малые интерферирующие РНК, осуществляющие процесс так называемой РНК-интерференции, обладают невероятным потенциалом для лечения рака», объясняет профессор Стивен Доуди (Steven Dowdy), руководивший исследованием: «и, хотя нам предстоит еще очень много сделать, на данный момент мы разработали технологию доставки препаратов в популяцию клеток – как первичной опухоли, так и метастазов, не повреждая при этом здоровые клетки».

Многие годы Доуди и его коллеги занимались изучением противоракового потенциала малых интерферирующих РНК. Однако обычные siRNA – крохотные отрицательно заряженные молекулы, которые из-за их свойств крайне сложно доставить в клетку. Чтобы добиться этого, ученые использовали короткий сигнальный белок PTD (peptide transduction domain). Ранее с его применением было создано более 50 «гибридных белков», в которых PTD был соединен с белками-супрессорами опухолевого роста.

Однако простое соединение siRNA с PTD не приводит к доставке РНК в клетку: siRNA заряжены отрицательно, PTD – положительно, в результате чего образуется плотный РНК-белковый конгломерат, не транспортирующийся через клеточную мембрану. Поэтому исследователи сначала соединили PTD с белковым РНК-связывающим доменом, который нейтрализовал отрицательный заряд siRNA (получив гибридный белок, названный PTD-DRBD). Такой РНК-белковый комплекс уже без труда проходит через клеточную мембрану и попадает в цитоплазму клетки, где специфически ингибирует матричные РНК белков, активирующих рост опухоли.

Чтобы выявить способность гибридного белка PTD-DRBD доставлять в клетки siRNA, ученые использовали клеточную линию, полученную из рака легких человека. После обработки клеток PTD-DRBD-siRNA было обнаружено, что наиболее восприимчивыми к siRNA являются клетки опухоли, в то время как в нормальных клетках (в качестве контроля использовались Т-клетки, эндотелиальные клетки и эмбриональные стволовые клетки), где не происходило повышенной продукции онкогенных белков, токсических эффектов не наблюдалось.

Данный метод можно подвергать различным модификациям, используя разные siRNA для подавления разных опухолевых белков – не только продуцирующихся в излишнем количестве, но и мутантных. Также возможно модифицировать терапию в случае рецидивов опухолей, которые обычно за счет новых мутаций становятся невосприимчивыми к химиотерапевтическим препаратам.

Онкологические заболевания очень вариабельны, а молекулярные характеристики белков опухолевых клеток индивидуальны для каждого пациента. Авторы работы считают, что в данной ситуации применение малых интерферирующих РНК – наиболее рациональный подход к терапии.

Метафора, лежащая в основе названия явления РНК-интерференции, отсылает к опыту с петунией, когда искусственно введённые в растение гены синтетазы розового и фиолетового пигментов не увеличили интенсивность окраски, а, наоборот, уменьшили её. Аналогично, в «обычной» интерференции наложение двух волн может приводить к взаимному «гашению».

В живой клетке поток информации между ядром и цитоплазмой никогда не иссякает, однако понимание всех его «завихрений» и расшифровка закодированной в нём информации – воистину титаническая задача. Одним из важнейших рывков в биологии прошлого века можно считать открытие молекул информационных (или матричных) РНК (иРНК или мРНК), которые служат посредниками, переносящими информационные «сообщения» из ядра (с хромосом) в цитоплазму. Определяющая роль РНК в синтезе белков была предсказана ещё в 1939 году в работе Торбьёрна Касперссона (Torbjörn Caspersson), Жана Брачета (Jean Brachet) и Джека Шульца (Jack Schultz), а в 1971 году Джордж Марбайс (George Marbaix) запустил синтез гемоглобина в ооцитах лягушки, сделав инъекцию впервые выделенной матричной РНК кролика, кодирующей этот белок .

В 1956-57 годах в Советском Союзе А. Н. Белозерский и А. С. Спирин независимо доказали существование мРНК, а также выяснили, что основную массу РНК в клетке составляет отнюдь не матричная, а рибосомальная РНК (рРНК). Рибосомальная РНК – второй «главный» вид клеточной РНК – образует «скелет» и функциональный центр рибосом у всех организмов; именно рРНК (а не белки) регулирует основные этапы белкового синтеза. Одновременно был описан и изучен и третий «главный» вид РНК – транспортные РНК (тРНК), которые в комплексе с двумя другими – мРНК и рРНК – формируют единый белок-синтезирующий комплекс. Согласно достаточно популярной гипотезе «мира РНК», именно эта нуклеиновая кислота лежала у самых истоков жизни на Земле .

В связи с тем, что РНК значительно более гидрофильна по сравнению с ДНК (за счет замены дезоксирибозы на рибозу), она более лабильна и может относительно свободно перемещаться в клетке, а значит и доставлять короткоживущие реплики генетической информации (мРНК) к месту, где начинается белковый синтез. Однако стоит отметить и связанное с этим «неудобство» – РНК очень нестабильна. Она намного хуже, чем ДНК, хранится (даже внутри клетки) и деградирует при малейшей перемене условий (температура, рН). Кроме «собственной» нестабильности, большой вклад принадлежит рибонуклеазам (или РНКазам) – классу расщепляющих РНК ферментов, очень стабильных и «вездесущих» – даже кожа рук экспериментатора содержит достаточное количество этих ферментов, чтобы перечеркнуть весь эксперимент. Из-за этого работать с РНК намного сложнее, чем с белками или ДНК – последняя вообще может храниться сотни тысяч лет практически без повреждений .

Фантастическая аккуратность при работе, тридистиллят, стерильные перчатки, одноразовая лабораторная посуда – всё это необходимо для предотвращения деградации РНК, однако соблюдение таких стандартов не всегда было возможным. Поэтому долгое время на короткие «обломки» РНК, неизбежно загрязнявшие растворы, попросту не обращали внимания. Однако со временем стало ясно, что, несмотря на все усилия по поддержанию стерильности рабочей области, «обломки» закономерно продолжали обнаруживаться, а потом выяснилось, что в цитоплазме всегда присутствуют тысячи коротких двуцепочечных РНК, выполняющих вполне определённые функции, и абсолютно необходимых для нормального развития клетки и организма.

Принцип РНК-интерференции

Сегодня изучение малых регуляторных РНК является одной из наиболее бурно развивающихся областей молекулярной биологии. Обнаружено, что все короткие РНК выполняют свои функции на основе явления, названного РНК-интерференцией (суть этого феномена заключается в подавлении экспрессии гена на стадии транскрипции или трансляции при активном участии малых молекул РНК). Очень схематично механизм РНК-интерференции показан на рис.1:

Рис. 1. Основы РНК-интерференции
Двуцепочечные молекулы РНК (дцРНК) нехарактерны для нормальных клеток, но они являются обязательным этапом жизненного цикла многих вирусов. Специальный белок Dicer, обнаружив в клетке дцРНК, «режет» её на небольшие фрагменты. Антисмысловая цепь такого фрагмента, которую уже можно называть короткой интерферирующей РНК (киРНК, от siRNA – small interference RNA), связывается комплексом белков под названием RISC (RNA-induced silencing complex), центральный элемент которого – эндонуклеаза семейства Argonaute. Связывание с киРНК активирует RISC и запускает в клетке поиск молекул ДНК и РНК, комплементарных «шаблонной» киРНК. Судьба таких молекул – быть уничтоженными или инактивированными комплексом RISC.

Подытоживая, короткие «обрезки» чужеродной (в том числе, введённой намеренно) двуцепочечной РНК служат «шаблоном» для широкомасштабного поиска и уничтожения комплементарных мРНК (а это эквивалентно подавлению экспрессии соответствующего гена), – причем, не только в одной клетке, но и в соседних. Для многих организмов – простейших, моллюсков, червей, насекомых, растений – этот феномен является одним из основных способов иммунной защиты против инфекций.

В 2006 году Эндрю Файер (Andrew Fire) и Крейг Мелло (Craig Mello) получают Нобелевскую премию по физиологии и медицине «За открытие явления РНК-интерференции – механизма сайленсинга генов при участии дцРНК». Хотя сам феномен РНК-интерференции был описан задолго до того (ещё в начале 1980-х), именно работы Файера и Мелло в общих чертах определили регуляторный механизм малых РНК и обрисовали неведомую до той поры область молекулярных исследований. Вот основные результаты их работ:

• При РНК-интерференции расщепляется именно мРНК (и никакая другая);
• Двуцепочечная РНК действует (вызывает расщепление) значительно эффективнее одноцепочечной. Эти два наблюдения предсказывали существование специализированной системы, опосредующей действие дцРНК;
• дцРНК, комплементарная участку зрелой мРНК, вызывает расщепление последней. Это указывало на цитоплазматическую локализацию процесса и наличие специфической эндонуклеазы;
• Небольшого количества дцРНК (нескольких молекул на клетку) достаточно для полного «выключения» целевого гена, что указывает на существование каскадного механизма катализа и/или амплификации.

Эти результаты заложили фундамент целому направлению современной молекулярной биологии – РНК-интерференции – и определили вектор работы множества исследовательских групп по всему миру не на один десяток лет. К текущему моменту обнаружено три большие группы малых РНК, которые играют на молекулярном поле за «команду РНК-интерференции». Познакомимся с ними подробнее.

Игрок № 1 – короткие интерферирующие РНК

Специфичность РНК-интерференции определяется короткими интерферирующими РНК (киРНК) – небольшими двуцепочечными молекулами РНК с чётко определённой структурой (см. рис.2).

киРНК эволюционно наиболее ранние, и распространены шире всего у растений, одноклеточных организмов и беспозвоночных . У позвоночных в норме киРНК практически не обнаружены, потому что их вытеснили более поздние «модели» коротких РНК (см. далее).

киРНК – «шаблоны» для поиска в цитоплазме и уничтожения молекул мРНК – имеют длину 20–25 нуклеотидов и «особую примету»: по 2 неспаренных нуклеотида на 3’-концах и фосфорилированные 5’-концы. Анти-смысловая киРНК способна (не сама, конечно, а с помощью RISC-комплекса) распознавать мРНК и специфически вызывать её деградацию: разрез целевой мРНК всегда происходит точно в месте, комплементарном 10 и 11 нуклеотидам анти-смысловой цепи киРНК.

Рис. 2. Механизм «интерференции» мРНК и киРНК
«Интерферирующие» короткие молекулы РНК могут как попадать в клетку извне, так и «нарезаться» уже на месте из более длинных двуцепочечных РНК. Основной белок, необходимый для «нарезания» дцРНК, – эндонуклеаза Dicer. «Выключение» гена по механизму интерференции осуществляется киРНК совместно с белковым комплексом RISC, который состоит из трёх белков – эндонуклеазы Ago2 и двух вспомогательных белков PACT и TRBP. Позже было обнаружено, что комплексы Dicer и RISC могут использовать в качестве «затравки» не только дцРНК, но и одноцепочечную РНК, формирующую двуцепочечную шпильку, а также готовую киРНК (последняя минует стадию «нарезания» и сразу связывается с RISC).

Функции киРНК в клетках беспозвоночных достаточно разнообразны. Первая и основная – это иммунная защита. «Традиционная» иммунная система (лимфоциты + лейкоциты + макрофаги) присутствует лишь у сложных многоклеточных организмов. У одноклеточных же, беспозвоночных и растений (у которых такой системы либо нет, либо она находится в зачаточном состоянии) иммунная защита строится на основе РНК-интерференции. Иммунитет, основанный на РНК-интерференции, не нуждается в сложных органах «тренировки» предшественников иммунных клеток (селезенка, тимус); в то же время, многообразие теоретически возможных последовательностей коротких РНК (421 вариантов) соотносимо с числом возможных белковых антител высших животных. Кроме того, киРНК синтезируются на основе инфицировавшей клетку «враждебной» РНК, а значит, в отличие от антител, они сразу «затачиваются» под конкретный тип инфекции. И хотя вне клетки защита на основе РНК-интерференции не работает (по крайней мере, таких данных пока нет), внутриклеточный иммунитет она обеспечивает более чем удовлетворительно.

Прежде всего, киРНК создаёт антивирусный иммунитет, уничтожая мРНК или геномную РНК инфекционных организмов (например, так киРНК и были открыты у растений ). Введение вирусной РНК вызывает мощную амплификацию специфических киРНК на основе молекулы-затравки – самой вирусной РНК. Кроме того, киРНК подавляют экспрессию различных мобильных генетических элементов (МГЭ), а значит, обеспечивает защиту и от эндогенных «инфекций». Мутации в генах RISC-комплекса часто ведут к повышению нестабильности генома из-за высокой активности МГЭ; киРНК может быть ограничителем экспрессии собственных генов, срабатывая в ответ на их гиперэкспрессию. Регуляция работы генов может происходить не только на уровне трансляции, но и во время транскрипции – через метилирование генов по гистону Н3.

В современной экспериментальной биологии значение РНК-интерференции и коротких РНК трудно переоценить. Разработана технология «выключения» (или нокдауна) отдельных генов in vitro (на культурах клеток) и in vivo (на эмбрионах), что уже стало стандартом de facto при изучении любого гена. Иногда даже, чтобы установить роль отдельных генов в каком-нибудь процессе, проводят систематическое «выключение» всех генов по очереди .

Возможностью применения киРНК заинтересовались и фармацевты, поскольку способность направленной регуляции работы отдельных генов сулит неслыханные перспективы в лечении массы заболеваний. Небольшой размер и высокая специфичность действия обещают высокую эффективность и низкую токсичность лекарств на основе киРНК; однако решить проблему доставки киРНК к больным клеткам в организме пока не удалось – виной тому хрупкость и недолговечность этих молекул. И хотя сейчас десятки коллективов пытаются найти способ направлять эти «волшебные пули» точно в цель (внутрь больных органов), видимых успехов они пока не достигли. Кроме этого, есть и другие сложности. Например, в случае антивирусной терапии высокая избирательность действия киРНК может оказать «медвежью услугу» – поскольку вирусы быстро мутируют, изменённый штамм очень быстро потеряет чувствительность к киРНК, подобранной в начале терапии: известно, что замена всего лишь одного нуклеотида в киРНК приводит к существенному снижению эффекта интерференции.

В этом месте стоит напомнить ещё раз – киРНК были обнаружены только у растений, беспозвоночных и одноклеточных; хотя гомологи белков для РНК-интерференции (Dicer, RISC-комплекс) присутствуют и у высших животных, киРНК привычными методами не обнаруживались. Каково же было удивление, когда искусственно введённые синтетические аналоги киРНК вызывали сильный специфический дозозависимый эффект в культурах клеток млекопитающих! Это означало, что в клетках позвоночных РНК-интерференция не заместилась более сложными системами иммунитета, а эволюционировала вместе с организмами, превратившись во что-то более «продвинутое». Следовательно, у млекопитающих надо было искать не точные аналоги киРНК, а их эволюционных преемников.

Игрок № 2 – микроРНК

Действительно, на основе эволюционно достаточно древнего механизма РНК-интерференции у более развитых организмов появились две специализированные системы управления работой генов, использующие каждая свою группу малых РНК – микроРНК (microRNA) и пиРНК (piRNA, Piwi-interacting RNA). Обе системы появились ещё у губок и кишечнополостных и эволюционировали вместе с ними, вытеснив киРНК и механизм «голой» РНК-интерференции. Их роль в обеспечении иммунитета снижается, поскольку эту функцию взяли на себя более совершенные механизмы клеточного иммунитета, – в частности, интерфероновая система. Однако эта система настолько чувствительна, что срабатывает и на саму киРНК: появлении в клетке млекопитающих малых двуцепочечных РНК запускает «сигнал тревоги» (активирует секрецию интерферона и вызывает экспрессию интерферон-зависимых генов, что блокирует все процессы трансляции целиком). В этой связи механизм РНК-интерференции у высших животных опосредован в основном микроРНК и пиРНК – одноцепочечными молекулами со специфической структурой, которая не обнаруживаются интерфероновой системой.

По мере усложнения генома микроРНК и пиРНК принимали всё большее участие в регуляции транскрипции и трансляции. Со временем, они превратились в дополнительную, точную и тонкую систему регуляции генома. В отличие от киРНК, микроРНК и пиРНК (открыты в 2001 году, см. рис.3, А-В) не производятся из чужеродных двуцепочечных молекул РНК, а изначально закодированы в геноме организма-хозяина .

Предшественник микроРНК транскрибируется с обеих цепей геномной ДНК РНК-полимеразой II, в результате чего появляется промежуточная форма – при-микроРНК, – несущая признаки обычной мРНК – m7G-кэп и полиА-хвост. В этом предшественнике образуется петля с двумя одноцепочечными «хвостами» и несколькими неспаренными нуклеотидами в центре (рис. 3А). Такая петля подвергается двухстадийному процессингу (рис. Б): вначале эндонуклеаза Drosha отрезает от шпильки одноцепочечные «хвосты» РНК, после чего вырезанная шпилька (пре-микроРНК) экспортируется в цитоплазму, где узнается Dicer’ом, вносящим ещё два разреза (вырезается двуцепочечный участок, обозначенный цветом на рис. 3А). В таком виде зрелая микроРНК, аналогично киРНК, включается в состав комплекса RISC.

Механизм действия многих микроРНК аналогичен действию киРНК: короткая (21–25 нуклеотидов) одноцепочечная РНК в составе белкового комплекса RISC с высокой специфичностью связывается с комплементарным участком в 3’-нетранслируемой области мРНК-мишени. Связывание приводит к расщеплению мРНК белком Ago. Однако активность микроРНК (по сравнению с киРНК) уже более дифференцирована – если комплементарность не абсолютная, целевая мРНК может не деградировать, а только обратимо блокироваться (трансляции не будет). Тот же RISC-комплекс может использовать и искусственно введённые киРНК. Это объясняет, почему киРНК, сделанные по аналогии с простейшими, активны и у млекопитающих.

Таким образом, мы можем дополнить иллюстрацию механизма действия РНК-интерференции у высших (билатерально-симметричных) организмов, объединив на одном рисунке схему действия микроРНК и биотехнологически введённых киРНК (рис. 3В).

Рис. 3А: Структура двуцепочечной молекулы-предшественника микроРНК
Основные особенности: наличие консервативных последовательностей, которые формируют шпильку; наличие комплементарной копии (микроРНК*) с двумя «лишними» нуклеотидами на 3’-конце; специфическая последовательность (2–8 п. н.), формирующая сайт узнавания для эндонуклеаз. Сама микроРНК выделена красным цветом – именно её и вырезает Dicer.

Рис. 3Б: Общий механизм процессинга микроРНК и реализации её активности

Рис. 3В: Обобщённая схема действия искусственных микроРНК и киРНК
Искусственные киРНК вводятся в клетку с помощью специализированных плазмид (targeting siRNA vector).

Функции микроРНК

Физиологические функции микроРНК крайне разнообразны – фактически, они выступают основными небелковыми регуляторами онтогенеза. микроРНК не отменяют, а дополняют «классическую» схему регуляцию генов (индукторы, супрессоры, компактизация хроматина и т. д.). Кроме того, синтез самих микроРНК сложным образом регулируются (определенные пулы микроРНК могут включаться интерферонами, интерлейкинами, фактором некроза опухолей α (ФНО-α) и многими другими цитокинами). В результате вырисовывается потрясающая по своей сложности и гибкости многоуровневая сеть настройки «оркестра» из тысяч генов, но и этим дело не заканчивается.

микроРНК более «универсальны», чем киРНК: «подопечные» гены не обязательно должны быть на 100% комплементарны – регуляция осуществляется и при частичном взаимодействии. На сегодня одна из самых горячих тем в молекулярной биологии – поиск микроРНК, которые выступают альтернативными регуляторами известных физиологических процессов. Например, уже описаны микроРНК, участвующие в регуляции клеточного цикла и апоптоза у растений, дрозофилы и нематоды; у человека микроРНК регулируют иммунную систему и развитие гематопоэтических стволовых клеток . Применение технологий на основе биочипов (micro-array screening) показало, что на различных этапах жизни клеток включаются и выключаются целые пулы малых РНК. Для биологических процессов идентифицировали десятки специфичных микроРНК, уровень экспрессии которых в определённых условиях изменяется в тысячи раз, подчёркивая исключительную управляемость этих процессов.

До недавнего времени считалось, что микроРНК только подавляют – полностью или частично – работу генов. Однако недавно оказалось: действие микроРНК может кардинально отличаться в зависимости от состояния клетки! В активно делящейся клетке микроРНК, связавшись с комплементарной последовательностью в 3’-участке мРНК, ингибирует синтез белка (трансляцию). Однако в состоянии покоя или стресса (например, при росте на бедной среде) то же самое событие приводит к прямо противоположному эффекту – усилению синтеза целевого белка !

Эволюция микроРНК

Количество разновидностей микроРНК у высших организмов ещё до конца не установлено – по некоторым данным, оно превосходит 1% от числа белок-кодирующих генов (у человека, например, говорят о 700 микроРНК, и это число постоянно растет). микроРНК регулируют активность около 30% всех генов (мишени для многих из них пока не известны), причём существуют как повсеместно распространённые, так и тканеспецифичные молекулы – например, один такой важный пул микроРНК регулирует созревание стволовых клеток крови.

Широкий профиль экспрессии в разных тканях разных организмов и биологическая распространённость микроРНК говорит об эволюционно древнем происхождении. Впервые микроРНК обнаружили у нематод, и долгое время потом считали, что эти молекулы появляются лишь у губок и кишечнополостных; однако позже их открыли и в одноклеточных водорослях . Интересно, что по мере усложнения организмов увеличивается также количество и гетерогенность пула микроРНК. Это косвенно свидетельствует о том, что сложность этих организмов обеспечивается, в частности, функционированием микроРНК . Возможная эволюция микроРНК показана на рис.4.

Рис. 4. Многообразие микроРНК у разных организмов
Чем выше организация организма, тем больше у него обнаруживается микроРНК (число в скобках). Красным выделены виды, у которых обнаружены единичные микроРНК. По данным .

Между киРНК и микроРНК можно провести чёткую эволюционную связь, опираясь на следующие факты:

• действие обоих видов взаимозаменяемо и опосредуется гомологичными белками;
• киРНК, введённые в клетки млекопитающих, специфично «выключают» нужные гены (несмотря на некоторую активацию интерфероновой защиты);
• микроРНК обнаруживаются у всё более и более древних организмов.

Эти и другие данные позволяют предположить происхождение обеих систем от общего «предка». Интересно также отметить, что «РНКовый» иммунитет как независимый предшественник белковых антител подтверждает теорию зарождения первых форм жизни на основе РНК, а не белков (напомним, что это любимая теория академика А. С. Спирина ).

Пока на арене молекулярной биологии было только два «игрока» – киРНК и микроРНК – основное «предназначение» РНК-интерференции казалось совершенно понятным. Действительно: набор гомологичных коротких РНК и белков у разных организмов осуществляет аналогичные действия; по мере усложнения организмов усложняется и функциональность.

Однако в процессе эволюции природа создала ещё одну, эволюционно самую позднюю и узкоспециализированную систему на основе всё того же удачного принципа РНК-интерференции. Речь идет пиРНК (piRNA, от Piwi-interaction RNA).

Чем сложнее организован геном, тем более развит и приспособлен организм (или наоборот? ;-). Однако увеличение сложности генома имеет и оборотную сторону: сложная генетическая система становится нестабильной. Это ведет к необходимости механизмов, отвечающих за поддержание целостности генома – иначе самопроизвольное «перемешивание» ДНК просто выведет её из строя. Мобильные генетические элементы (МГЭ) – один из основных факторов нестабильности генома – представляют собой короткие нестабильные участки, которые могут автономно транскрибироваться и мигрировать по геному. Активация таких мобильных элементов приводит к множественным разрывам ДНК в хромосомах, чреватых летальными последствиями.

Количество МГЭ нелинейно увеличивается с размером генома, и их активность необходимо сдерживать. Для этого животные, уже начиная с кишечнополостных, используют всё тот же феномен РНК-интерференции. Эту функцию также выполняют короткие РНК, однако не те, о которых речь уже шла, а третий их тип – пиРНК.

«Портрет» пиРНК

пиРНК – короткие молекулы длиной в 24-30 нуклеотидов, закодированные в центромерных и теломерных областях хромосомы. Последовательности многих из них комплементарны известным мобильным генетическим элементам, однако есть множество других пиРНК, совпадающих с участками рабочих генов или с фрагментами генома, функции которых неизвестны.

пиРНК (также как и микроРНК) закодированы в обеих цепях геномной ДНК; они весьма изменчивы и разнообразны (до 500 000 (!) видов в одном организме). В отличие от киРНК и микроРНК, они образуются одной цепью с характерной особенностью – урацилом (U) на 5’-конце и метилированным 3’-концом. Есть и другие отличия:

• В отличие от киРНК и микроРНК, они не требуют процессинга Dicer’ом;
• Гены пиРНК активны только в зародышевых клетках (во время эмбриогенеза) и окружающих их эндотелиальных клетках;
• Белковый состав системы пиРНК иной – это эндонуклеазы класса Piwi (Piwi и Aub) и отдельная разновидность Argonaute – Ago3.

Процессинг и активность пиРНК пока достаточно плохо изучены, но уже ясно, что механизм действия совершенно отличается от других коротких РНК – сегодня предложена пинг-понг модель их работы (рис.5 А,Б).

Пинг-понг механизм биогенеза пиРНК

Рис. 5А: Цитоплазматическая часть процессинга пиРНК
Биогенез и активность пиРНК опосредуется семейством эндонуклеаз Piwi (Ago3, Aub, Piwi). Активность пиРНК обеспечивается обеими одноцепочечными молекулами пиРНК – смысловой и анти-смысловой, – каждая из которых ассоциирует со специфической эндонуклеазой Piwi. пиРНК узнает комплементарный участок мРНК транспозона (синяя цепь) и вырезает его. Это не только инактивирует транспозон, но и создает новую пиРНК (связанную с Ago3 с помощью метилирования метилазой Hen1 3’-конца). Такая пиРНК, в свою очередь, узнаёт мРНК с транскриптами кластера предшественников пиРНК (красная цепь) – таким способом цикл замыкается и снова вырабатывается нужная пиРНК .

Рис. 5Б: пиРНК в ядре
Кроме эндонуклеазы Aub, антисмысловую пиРНК может связывать и эндонуклеаза Piwi. После связывания комплекс мигрирует в ядро, где вызывает деградацию комплементарных транскриптов и перестройку хроматина, вызывающую подавление активности транспозонов.

Функции пиРНК

Главная функция пиРНК – подавление активности МГЭ на уровне транскрипции и трансляции. Считается, что пиРНК активны только во время эмбриогенеза, когда непредсказуемые перетасовки генома особенно опасны и могут привести к гибели зародыша. Это логично – когда иммунная система ещё не заработала, клетки эмбриона нуждаются в какой-нибудь простой, но действенной защите. От внешних патогенов эмбрион надежно защищен плацентой (или оболочкой яйца). Но кроме этого необходима оборона и от эндогенных (внутренних) вирусов, – в первую очередь МГЭ.

Эта роль пиРНК подтверждена опытом – «нокаут» или мутации генов Ago3, Piwi или Aub приводят к серьёзным нарушениям развития (и резкому увеличению числа мутаций в геноме такого организма), а также вызывают бесплодие за счёт нарушения развития половых клеток.

Распространение и эволюция пиРНК

Первые пиРНК обнаруживаются уже у актиний и губок. Растения, видимо, пошли другим путём – белки Piwi у них не обнаружены, а роль «намордника» для транспозонов выполняют эндонуклеаза Ago4 и киРНК.

У высших животных – в том числе и человека – система пиРНК развита очень хорошо, но встретить её можно только в эмбриональных клетках и в околоплодном эндотелии. Почему распространение пиРНК в организме столь ограничено – ещё предстоит узнать. Можно предположить, что, как и любое мощное оружие, пиРНК приносит пользу только в очень специфических условиях (во время развития плода), а во взрослом организме их активность нанесёт больше вреда, чем пользы. Все-таки, число пиРНК на порядок превосходит количество известных белков – и неспецифические эффекты пиРНК в зрелых клетках сложно предсказать.

Сводная таблица. Свойства всех трёх классов коротких РНК

	киРНК	микроРНК	пиРНК
Распространение	Растения, Drosophila , C. elegans . Не найдено у позвоночных	Эукариоты	Эмбриональные клетки животных (начиная с кишечнополостных). Нет у простейших и растений
Длина	21-22 нуклеотидов	19-25 нуклеотидов	24-30 нуклеотидов
Структура	Двуцепочечная, по 19 комплементарных нуклеотидов и два неспаренных нуклеотида на 3’-конце	Одноцепочечная сложная структура	Одноцепочечная сложная структура. U на 5’-конце, 2’-O -метилированный 3’-конец
Процессинг	Dicer-зависимый	Dicer-зависимый	Dicer-независимый
Эндонуклеазы	Ago2	Ago1, Ago2	Ago3, Piwi, Aub
Активность	Деградация комплементарных мРНК, ацетилирование геномной ДНК	Деградация или ингибирование трансляции целевой мРНК	Деградация мРНК, кодирующих МГЭ, регуляция транскрипции МГЭ
Биологическая роль	Антивирусная иммунная защита, подавление активности собственных генов	Регуляция активности генов	Подавление активности МГЭ во время эмбриогенеза

Заключение

В заключение хочется привести таблицу, иллюстрирующую эволюцию белкового аппарата, участвующего в РНК-интерференции (рис.6). Видно, что у простейших наиболее развита система киРНК (белковые семейства Ago, Dicer), а с усложнением организмов акцент переносится на более специализированные системы – увеличивается число изоформ белков для микроРНК (Drosha, Pasha) и пиРНК (Piwi, Hen1). При этом разнообразие ферментов, опосредующих действие киРНК, уменьшается.

Рис. 6. Многообразие белков, участвующих в РНК-интерференци и
Цифры обозначают количество белков каждой группы. Синим цветом подсвечены элементы, характерные для киРНК и микроРНК, а красным – белки, связанные с пиРНК. По данным .

Явление РНК-интерференции начали использовать уже простейшие организмы. На основе этого механизма природа создала прототип иммунной системы, а по мере усложнения организмов РНК-интерференция становится незаменимым регулятором активности генома. Два разных механизма плюс три вида коротких РНК (см. сводную таблицу) – в результате мы видим тысячи тонких регуляторов различных метаболических и генетических путей. Эта поразительная картина иллюстрирует универсальность и эволюционную адаптацию молекулярных биологических систем. Короткие РНК снова доказывают, что «мелочей» внутри клетки нет – есть только мелкие молекулы, всю значимость роли которых мы только начинаем понимать.

Правда, такая фантастическая сложность говорит скорее о том, что эволюция «слепа» и действует без наперёд утверждённого «генерального плана» .

Литература

1. Gurdon J.B., Lane C.D., Woodland H.R., Marbaix G. (1971). Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells . Nature 233, 177-182;
2. Спирин А. С. (2001). Биосинтез белков, мир РНК и происхождение жизни . Вестник РАН 71, 320-328;
3. Элементы: «Полные митохондриальные геномы вымерших животных теперь можно извлекать из волос »;
4. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans . Nature 391, 806-311;
5. Биомолекула: «МикроРНК впервые обнаружены в одноклеточном организме »;
6. Covey S., Al-Kaff N., Lángara A., Turner D. (1997). Plants combat infection by gene silencing . Nature 385, 781-782;
7. Биомолекула: «Молекулярное двурушничество: гены человека работают на вирус гриппа »;
8. Ren B. (2010). Transcription: Enhancers make non-coding RNA . Nature 465, 173–174;
9. Taganov K.D., Boldin M.P., Chang K.J., Baltimore D. (2006). NF-κB-dependent induction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses . Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 12481-12486;
10. O’Connell R.M., Rao D.S., Chaudhuri A.A., Boldin M.P., Taganov K.D., Nicoll J., Paquette R.L., Baltimore D. (2008). Sustained expression of microRNA-155 in hematopoietic stem cells causes a myeloproliferative disorder . J. Exp. Med. 205, 585-594;
11. Биомолекула: «микроРНК – чем дальше в лес, тем больше дров »;
12. Элементы: «Усложнение организма у древних животных было связано с появлением новых регуляторных молекул »;
13. Grimson A., Srivastava M., Fahey B., Woodcroft B.J., Chiang H.R., King N., Degnan B.M., Rokhsar D.S., Bartel D.P. (2008). Early origins and evolution of microRNAs and Piwi-interacting RNAs in animals . Nature 455, 1193–1197.
14. Aravin A., Hannon G, Brennecke J. (2007). The Piwi-piRNA Pathway Provides an Adaptive Defense in the Transposon Arms Race . Science 318, 761–764;
15. Биомолекула: «

А.М. Дейчман, С.В.Зиновьев, А.Ю.Барышников

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ И МАЛЫЕ РНК В ОНКОЛОГИИ

ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

РЕЗЮМЕ

В статье представлена роль малых РНК, контролирующих большинство жизненно важных функций клетки и организма, и возможная связь их, в частности, с онкогенезом и другими (включая гипотетические) внутриклеточными механизмами геномной экспрессии.

Ключевые слова : малые РНК, интерференция РНК (РНКи), двунитевая РНК (днРНК), редактирование РНК, онкогенез.

A.M. Deichman , S.V.Zinoviev, A.Yu.Baryshnikov.

THE GENE EXPRESSION AND SMALL RNAS IN ONCOLOGY

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Mosc ow

ABSTRACT

In the paper role of small RNAs supervising the majority vital functions of cell and organism and possible connection of them in particular with oncogenesis and others (including hypothetical) intracellular mechanisms of genome expression is submitted.

Key words : Small RNAs, interference RNAs (RNAi), double strand RNAs (dsRNAs), RNA editing, tumorogenesis.

Введение

Экспрессия отдельных генов и целых геномов эукариот, включая процессинг, различные виды транскрипции, сплайсингов, перестановок, редактирования РНК, рекомбинаций, трансляцию, интерференцию РНК, регулируется некоторыми белками (продуктами регуляторных, структурных, гомеозисных генов, транскрипционными факторами), подвижными элементами, РНК и низкомолекулярными эффекторами. Среди процессирующих РНК – рРНК, тРНК, мРНК, некоторые виды регуляторных РНК и малые РНК.

К настоящему времени известно, что малые РНК не кодируют белок, часто исчисляются сотнями на геном и участвуют в регуляции экспрессии различных эукариотических генов (соматических, иммунных, герминативных, стволовых клеток). Под контролем оказываются процессы дифференцировки, (гематопоэз, ангиогенез, адипогенез, миогенез, нейрогенз), морфогенеза (включая эмбриональные стадии, развитие/рост, физиологическую регуляцию), пролиферации, апоптоза, канцерогенеза, мутагенеза, иммуногенеза, старения (продления жизни), эпигенетического сайленсинга ; отмечены случаи метаболической регуляции (например, гликосфинголипидов ). Более широкий класс некодирующих РНК в 20-300/500 нуклеотидов и их РНП обнаружены не только в ядре/ядрышке/цитоплазме , но и в ДНК-содержащих клеточных органеллах (митохондриях животных ; у растений найдены микро-РНК и консенсусные к транскриптам хлоропластов последовательности малых РНК ).

Для управления и регуляции в.н. процессами важно: 1. что небольшие по размерам естественные/искусственные РНК (малые РНК, тРНК, подобн.) и их комплексы с белками (РНП) способны к чрезмембранному клеточному и митохондриальному транспорту ; 2. что после распада митохондрий часть их содержимого, РНК и РНП, могут оказаться в цитоплазме и ядре. Перечисленные свойства малых РНК (РНП), функционально значимая роль которых в процессе изучения только увеличивается, очевидно, имеют связь с фактором настороженности в отношении рака и других генетических заболеваний . Одновременно прояснилась высокая значимость эпигеномных моди-фикаций хроматина при возникнове-нии опухолей . Мы рассмотрим только очень ограниченное число случаев из множества подобных.

Малые РНК

Механизм действия малых РНК состоит в способности их почти комплементарно связыватьтся с З"-нетранслируемыми областями (З"-НТО) мРНК-мишеней (которые иногда содержат ДНК-/РНК-транспозирующие MIR/LINE-2-элементы, а также консервативные Alu-повторы) и вызывать интерференцию РНК (РНКи=RNAi; в частности, при антивирусном ответе) . Осложнение, однако, в том, что кроме клеточных существуют и вирус-кодируемые малые РНК (герпеса, SV40, др.; EBV, например, содержит 23, а KSHV – 12 miRNAs ), взаимодействующие с транскриптами и вируса и хозяина. Одних только клеточных/вирусных miRNAs известно более 5 тысяч у 58 видов . РНКи инициирует либо деградацию (с участием комплекса RISC, RNA-Induced Silencing Complex) по уязвимым для нуклеаз фрагментам непрерывных спиралей днРНК (двунитевых РНК мРНК, др.), либо частично обратимое ингибирование прерывисто спирализованных днРНК при трансляции мРНК-мишеней. Зрелые малые РНК (~15-28 нуклеотидов) образуются в цитоплазме из своих процессирующих в ядре предшественников различной длины (в десятки и сотни нуклеотидов) . Кроме того, малые РНК участвуют в формировании сайленсиноговой структуры хроматина, регуляции транскрипции отдельных генов, подавлении экспрес-сии транспозонов и поддержании функциональной структуры протяженных участков гетерохроматина .

Различают несколько основных видов малых РНК. Наиболее хорошо изучены микро-РНК (miRNAs) и малые интерферирующие РНК (siRNAs). Кроме того, среди малых РНК изучаются: активные в герминативных клетках piRNAs ; малые интерферирующие РНК, ассоциированные с эндогенными ретротранспозонами и повторяющимися элементами (при локальной/глобальной гетерохроматизации – начиная с ранних стадий эмбриогенеза; поддерживают уровень теломер), rasiRNAs дрозофиы ; часто кодируемые интронами белковых генов и функционально важные при трансляции, транскрипции, сплайсинге (де-/метилировании, псевдоуридилировании нуклеиновых кислот) малые ядерные (snRNAs) и ядрышковые (snoRNAs) РНК ; комплементарные ДНК-связывающим NRSE-(Neuron Restrictive Silenser Element)-мотивам малые модуляторные РНК, smRNAs, с малоизвестными функциями ; трансактивирующие малые интерферирующие РНК растений, tasiRNAs ; короткие шпилечные РНК, shRNAs, обеспечивающие долговременную РНКи (устойчивый генный сайленсинг) длинных днРНК-структур при антивирусном ответе у животных .

Малые РНК (miRNAs, siRNAs, др.) взаимодействуют с новосинтезируемыми транскриптами ядра/цитоплазмы (регулируя сплайсинг, трансляцию мРНК; метилирование/псевдоуридилирование рРНК, др.) и хроматина (при временно-локальной и эпигенетически наследуемой гетерохроматинизации делящихся соматических герминативных клеток) . Гетерохроматинизация, в частности, сопровождается де-/метилированием ДНК, а также метилированием, ацетилированием, фосфорилированием и убиквитинированием гистонов (модификация «гистонового кода») .

Первыми среди малых РНК были обнаружены и исследованы miRNAs нематоды Caenorhabditis elegans (lin-4), их свойства и гены , а несколько позже – miRNAs растения Arabidopsis thaliana . В настоящее время их связывают с многоклеточными организмами , хотя они показаны у одноклеточной водоросли Chlamydomonas reinhardtii , а РНКи-подобные пути сайленсинга, в связи с противовирусной/подобной защитой с участием т.н. psiRNAs, обсуждаются для прокариот . Геномы многих эукариот (в том числе дрозофилы, человека) содержат несколько сотен генов miRNAs. Эти стадио-/тканеспецифичные гены (как и соответствующие им участки мРНК-мишеней) часто высокогомологичны у филогенетически отдаленных видов, но некоторые из них – линиоспецифичны . miRNAs содержатся в экзонах (белок-кодирующих, РНК-генов), интронах (чаще всего пре-мРНК), межгенных спейсерах (включая повторы), имеют длину до 70-120 нуклеотидов (и более) и формируют шпилечные структуры типа петля/стебель . Для определения их генов используют не только биохимические и генетические, но и компьютерные подходы .

Наиболее характерная длина «рабочего участка» зрелых miRNAs – 21-22 нуклеотида. Возможно, это самые многочисленные среди не кодирующих белки генов. Они могут располагаться в виде отдельных копий (чаще) или кластеров, содержащих множество сходных или различных генов miRNAs, транскрибирующихся (не редко с автономных промоторов) в виде более длинного предшественника, процессируемого в несколько стадий до индивидуальных miRNAs . Предполагают, что существует регуляторная miRNA-сеть, контролирующая множество фун-даментальных биологических процессов (включая онкогенез/метастазирование); вероятно, не менее 30% экспрессируемых генов человека регулируются miRNAs .

В этом процессе участвуют днРНК-специфические РНКаза-III-подобные ферменты Drosha (ядерная рибонуклеаза; инициирует процессинг интронных пре-miRNAs после сплайсинга основного транскрипта) и Dicer, функционирующий в цитоплазме и расщепляющий/деградирующий, соответственно, шпилечные пре-miRNAs (до зрелых miRNAs) и образуемые позже гибридные miRNAs/мРНК структуры. Малые РНК, вместе с несколькими белками (включая в.н. РНКазы, белки AGO-семейства, трансметилазы/ацетилазы, др.) и с участием т.н. RISC- и RITS-подобных комплексов (второй – индуцирует транскрипционный сайленсинг), способны, соответственно, вызывать РНКи/деградацию и последующий генный сайленсинг на РНК- (до/при трансляции) и ДНК- (при транскрипции гетерохроматина) уровнях.

Каждая miRNA потенциально спаривается со множеством мишененй, а каждая мишень – контролируется рядом miRNAs (что напоминает gRNAs-опосредуемое редактирование пре-мРНК в кинетопластах трипаносом). Анализ in vitro показал, что miRNAs-регуляция (как и редактирование РНК) – ключевой посттранскрипционный модулятор экспрессии генов. Сходные miRNAs, конкурирующие за одну мишень – потенциальные трансрегуляторы РНК-РНК и РНК-белковых взаимодействий.

У животных miRNAs наиболее хорошо изучены для нематоды Caenorhabditis Elegans; описано более 112 генов. Здесь обнаружены и тысячи эндогенных siRNAs (генов нет; связаны, в частности, со сперматогенез-опосредуемыми транскриптами и транспозонами ). Обе малых РНК многоклеточных могут генерироваться РНК-полимеразами, проявлющими активность (не гомологию) RdRP-II (как для большинства других РНК) и RdRP-III типов . Зрелые малые РНК схожи по составу (влючая концевые 5"-фосфаты и З"-ОН), длине (обычно 21-22 нуклеотида) и функции, и могут конкурировать за одну мишень . Однако РНК-деградацию, и при полной комплементарности мишени, чаще ассоциируют с siRNAs; трансляционную репрессию, при частичной, обычно в 5-6 нуклеотидов, комплементарности – с miRNAs; а предшественники, соответственно, экзо-/эндогенные (в сотни/тысячи нуклеотидов) для siRNAs, и обычно эндогенные (в десятки/сотни нуклеотидов) для miRNAs и биогенез у них различны ; впрочем, в некоторых системах эти различия обратимы.

РНКи, опосредуемая siRNAs- и miRNAs, имеет разнообразные естественные роли: от регуляции экспрессии генов и гетерохроматина – до защиты генома против транспозонов и вирусов; но siRNAs и часть miRNAs не консервативны между видами. У растений (Arabidopsis thaliana) обнаружены: siRNAs, соответствующие как генам, так и межгенным (включая спейсеры, повторы) областям; огромное число потенциальных сайтов генома для различных типов малых РНК . У нематод открыты также т.н. изменчивые автономно экспрессируемые 21У-РНК (dasRNAs); они имеют 5"-У-монофосфат, составляют 21 нукдеотид (20-ть из них изменчивы), и располагаются между или внутри интронов белок-кодирующих генов по более чем 5700 сайтам двух областей IV хромосомы .

MiRNAs играют важную роль при экспрессии генов в норме и патологии; у человека – не менее 450-500 таких генов . Связываясь обычно с З"-НТО-областями мРНК (др. мишенями), они могут избирательно и количественно (в частности, при выведении из оборота продуктов низкоэкспрессируемых генов ), блокировать работу одних и активность других генов. Оказалось, что наборы профилей экспрессируемых микро-РНК (и их мишеней) динамически меняются в процессе онтогенеза, дифференцировки клеток и тканей. Эти изменения специфичны, в частности, при кардиогенезе , процессе оптимизации размеров длины дендритов и числа синапсов нервной клетки (с участием miRNA-134, др. малых РНК) , развитии многих патологий (онкогенезе, иммунодефицитах , генетических заболеваниях , паркинсонизме , болезни Альцгеймера , офтальмологических нарушениях (ретинобластома , др.), связаных с инфекциями различной природы ). Общее число обнаруживаемых miRNAs растет много быстрее, чем описание их регуляторной роли и связи с конкретными мишенями.

Компьютерный анализ предсказывает сотни мРНК-мишеней для отдельных miRNAs и регуляцию индивидуальных мРНК множеством miRNAs. Таким образом miRNAs могут служить целям элиминации транскриптов генов-мишеней, либо тонкой настройки их экспрессии на траскрипционном/трансляционном уровнях. Теоретическое рассмотрение и экспериментальные результаты подтверждают существование разнообразных ролей miRNAs.

Более полный перечень аспектов, связанных с фундаментальной ролью малых РНК у эукариот в процессах роста/развития и при некоторых патологиях (включая эпигеномику рака), отражены в обзоре .

Малые РНК в Онкологии

Процессы роста, развития, прогрессии и метастазирования опухолей сопровождаются множеством эпигенетических изменений, перерастающих в более редкие стойко-наследемые генетические изменения . Редкие мутации, однако, могут иметь большой вес (для конкретных индивида, нозологии), т.к. в отношении отдельных генов (например APC, K-ras, p53) возможен т.н. эффект «воронки», связанный с почти необратимыми развитием/последствиями онкозаболеваний. Опухолеспецифическая в отношении профиля экспрессии различных генов (белков, РНК, малых РНК) гетерогенность клеток-предшественников обусловливается сопряженными вариациями перестраиваемых эпигеномных структур. Эпигеном модулируется метилированием, посттрансляци-онными модификациями/заменами гистонов (на неканонические), ремоделингом нуклеосомной структуры генов/хроматина (включая геномный импринтинг, т.е. дисфункцию экспрессии аллелей родительских генов и Х-хромосом). Все это, и с участием РНКи, регулируемой малыми РНК, ведет к появлению дефектных гетерохроматиновых (включая гипометилированные центромерные ) структур .

Формированию ген-специфических мутаций может предшествовать известное накопление сотен тысяч соматических клональных мутаций в простых повторах или микросателлитах некодирующей (редко – кодирующей) области – по крайней мере в опухолях с микросателлитным мутаторным фенотипом (MMP) ; они составляют значительную часть колоректальных, а также раков легких, желудка, эндометрия, др. Нестабильные моно-/гетеронуклеотидные микросателлитные повторы (поли-А6-10, подобн.) содержатся во много раз чаще в контролирующих экспрессию генов регуляторных некодирующих (интроны, межгенно), чем в кодирующих (экзоны) областях генома микросателлит-нестабильных, MSI+, опухолей. Хотя природа появления и механизмы локализации MS-стабильных/нестабильных областей до конца не ясны, формирование MS-нестабильности коррелировало с частотой мутаций множества ранее не мутирующих в MSI+-опухолях генов и, вероятно, канализировало пути их прогрессии; причем частота мутаций MSI-повторов в этих опухолях увеличивалась более чем на два порядка . Не все гены проанализированы на наличие повторов, но степень мутабильности их в кодирующих/некодирующих областях различна, а точность методов определения частоты мутаций – относительна . Важно, что некодирующие области по MSI-мутабильным повторам часто биаллельны, а кодирующие – моноаллельны .

Глобальное снижение метилирования в опухолях характерно для повторов , мобильных элементов (МЭ; их транскрипция увеличивается), промоторов, CpG-сайтов опухолесупрессорных miRNA-генов и коррелирует с гипертранскрипцией ретротранспозонов в клетках прогрессирующих раков . В норме колебания «метилома» связаны с родительско-/стадио-/тканеспецифическими «волнами метилирования» и сильным метилированием центромерных сателлитных участков гетерохроматина, регулируемых малыми РНК. При недометилировании сателлитов формируемая нестабильность хромосом сопровождается усилением рекомбинации , а наруше-ние метилирования МЭ может запускать их экспрессию . Эти факторы благоприятствует развитию опухолевого фенотипа. Терапия малыми РНК может быть высокоспецифичной, но должна быть контролируемой, т.к. мишенями могут оказаться не только отдельные, но и множество мРНК/РНК молекул, и новосинтезируемые РНК различных (включая некодирующие межгенные повторы) областей хромосом .

Большую часть генома человека составляют повторы и МЭ. Ретротранспозон L1 (LINE элемент) содержит, как и эндогенные ретровирусы, ревертазу (RTase), эндонуклеазу и потенциально способен переносить неавтономные (Alu, SVA, др.) ретроэлементы ; сайленсинг L1/подобных элементов осуществляется в результате метилирования по CpG-сайтам . Заметим, что среди CpG-сайтов генома слабо метилированы CpG-островки промоторов генов, а сам 5-метилцитозин – потенциально мутагенное основание, дезаминируемое в тимин (химически, или при участии редактирования РНК/(ДНК), репарации ДНК); однако некоторые из CpG-островков подвержены избыточному аберрантному метилированию, сопровождаемому репрессией генов-супрессоров и развитию рака . Далее: РНК-связывающий белок, кодируемый L1, взаимодействуя с бел-ками AGO2 (семейства Argo-naute) и FMRP (fragile mental retardation, белок эффекторного RISC-комплекса ), способствует перемещению L1-элемента – что указывает на возможную взаиморегуля-цию систем РНКи и ретропозиции LINE элементов человека. Важно, в частности, что Alu-повторы способны перемещаться в область интрон/экзонного пространства генов .

Эти и подобные механизмы могут усиливать патологическую пластичность генома опухолевой клетки. Подавление RTase (кодируемой, как и эндонуклеаза, элементами L1; RTase также кодируется и эндогенными ретровирусами) по механиз-му РНКи сопровождалось снижением пролиферации и усилением дифференцировки в ряде раковых клеточных линий . При внедрении L1 элемента в протоонкоген или супрессорный ген наблюдали двунитевые разрывы ДНК . В тканях зародышевого пути (мышей/человека) уровень экспрессии L1 повышен, а его метилирование зависело от piRNAs-(26-30-п.о.)-связанной системы cайленсинга, где PIWI-белки – варианты большого семейства белков Argo-naute, мутации в которых ведут к деметилированию/дерепрессии L1/подобных элементов с длинными концевыми повторами. С PIWI-белками же в большей степени, чем с Dicer-1/2 и Ago-белками, связаны пути сайленсинга rasiRNAs . Опосредуемые piRNAs/siRNAs пути сайленсинга реализуются через внутриядерные тельца, содержащие крупные эволюционно-консервативные мультибелковые РсG-комплексы, функции которых в опухолевых клетках часто нарушаются. Эти комплексы отвечают за дальнодействие (через более чем 10 т.п.о., между хромосомами) и регулируют кластер генов HOX, ответ-ственных за план строения тела .

Но-вые принципы антисенс-терапии могут развиваться с учетом знаний о более высокоспецифичных (чем гистонмодифицирующие ингибиторы метилирова-ния ДНК/белков) противоопухолевых эпигеномных агентах, фундаментальных основ эпигеномного РНК-сайленсинга и роли малых РНК в канцеро-генезе .

Микро-РНК в Онкологии

Известно, что усиление опухолевого роста и метастазирования могут сопровождаться повышением одних и понижением экспрессии других индивидуальных/наборов miRNAs (табл. 1). Некоторые из них могут иметь причинную роль в онкогенезе; и даже одни и те же miRNAs (как miR-21/-24) в разных опухолевых клетках могут проявлять как онкогенные, так и супрессирующие свойства. Каждый тип злокачественных опухолей человека хорошо различим своим «miRNA-отпечатком», и некоторые miRNAs могут функционировать как онкогены, опухолевые супрессоры, инициаторы клеточной миграции, инвазии, метастазирования . В патологически измененных тканях часто обнаруживают пониженное количество ключевых miRNAs, вероятно включенных в системы противораковой защиты. Участвующие в онкогенезе miRNAs (miRs) сформировали представ-ление о т.н. «онкомирах» : анализ экспрессии более 200 miRNAs свыше 1000 образ-цов лимфом и со-лидных раков позволил успешно классифицировать опухоли на подтипы по их происхожде-нию и стадии дифференцировки . Функции и роль miRNAs успешно изучают с помощью: анти-miR-олигонуклеотидов, модифицирован-ных (для увеличения времени жизни) по 2"-О-метильным и 2"-О-метоксиэтильным группам ; а также LNA-олигонуклеотидов, в которых кислородные атомы рибозы в положениях 2" и 4" соединены метиленовым мос-тиком .

(табл. 1)……………….

Опухоль	miRNAs
Рак легких	17-92 , let-7↓ , 124a↓ , 126 ↓ , 143 ↓ , 145 ↓ , 155 , 191 , 205 , 210
Рак молочной железы	21 , 125b↓ , 145 ↓ , 155
Рак простаты	15a ↓ , 16-1 ↓ , 21 , 143 ↓ ,145 ↓
Рак кишечника	19a , 21 , 143 ↓ , 145 ↓
Рак поджелудочной железы	21 , 103 , 107 , 155 v
Рак яичника	210
Хроническая лимфоцитарная лейкемия	15a ↓ , 16-1 ↓ , 16-2 , 23 b , 24-1 , 29 ↓ , 146 , 155 , 195 , 221 , 223 ↓

Таблица 1 .

miRNAs, экспрессия которых увеличивается () или уменьшается (↓ ) в некоторых наиболее распространенных опухолях по сравнению с нормальными тканями (см. , а также ).

Считается, что регулирующая роль экспрессии, исчезновения и амплификации miRNA-генов в предрасположенности к инициации, росту и прогрессии большинства опухолей значительна, а мутации в парах miRNA/мРНК-мишень синхронизированы . Профиль экспрессии miRNAs может использоваться для классификации, диагностики и клинического прогноза в онкологии. Изменения в экспрессии miRNAs могут затрагивать клеточный цикл, программу выживаемости клетки . Мутации miRNAs в стволовых и соматических клетках (как и выбор полиморфных вариантов мРНК-мишеней) могут способствовать, или даже играть критическую роль при росте, прогрессии и патофизиологии многих (если не всех) злокачественных новообразований . С помощью miRNAs возможна коррекция апоптоза .

Кроме индивидуальных miRNAs обнаружены их кластеры, выступающие в роли онкогена, провоцирующего развитие, в частности, рака кроветворной ткани у подопытных мышей; гены miRNAs с онкогенными и супрессорными свой-ствами могут располагаться в одном кластере. Кластерный анализ профилей экспрессии miRNAs в опухолях позволяет определить ее происхождение (эпителий, кроветворная ткань, др.) и классифицировать разные опухоли одной ткани с неидентичными ме-ханизмами трансформации . Оценку профиля экспрессии miRNAs можно осуществлять с исполь-зованием нано-/микрочипов; точность такой классификации, при отработке технологии (что не просто), оказывается выше, чем с использова-нием профилей мРНК . Некоторые из miRNAs участвуют в дифференцировке гематопоэтических клеток (мышь, человек), инициации прогрессии раковых клеток . Человеческие miRNA-гены часто располагаются в т.н. «ломких» сайтах, областях с преобладанием делеций/вставок, точечных разрывов, транслокаций, транспозиций, минимально делетируемых и амплифицируемых областей гетерохроматина, вовлеченных в онкогенез .

Ангиогенез . Роль miRNAs в ангиогенезе, вероятно, значительна. Усиление ангиогенеза в некоторых Myc-активированных аденокарциномах человека сопровождалось изменением характера экспрессии одних miRNAs, а нокдаун генов других miRNAs вел к ослаблению и подавлению роста опухоли . Рост опухоли сопровождался мутациями в K-ras, Myc и TP53 генах, усилением продукции ангиогенного VEGF-фактора и степени Myc-ассоциированной васкуляризации; при этом антиангиогенные факторы Tsp1 и CTGF подавлялись miR-17-92 и др. кластер-ассоциированными miRNAs. Ангиогенез и васкуляризация опухоли усиливались (в частности, в колоноцитах) при коэкспрессии двух онкогенов в большей степени, чем одним .

Нейтрализация антиангиогенного LATS2 фактора, ингибитора циклинзависимой киназы животных (CDK2; человек/мышь), с помощью miRNAs-372/373 («потенциальные онкогены») стимулировала рост опухоли семенников без повреждения р53-гена .

Потенциальными модуляторами ангиогенных свойств (in-vitro/in-vivo) являются miR-221/222, мишени которых, рецепторы c-Kit (др.), – факторы ангиогенеза эндотелиальных венозных HUVEC клеток пуповины, др. Эти miRNAs и c-Kit взаимодействуют в рамках сложного цикла, контролирующего способность эндотелиальных клеток к формированию новых капилляров .

Хронический лимфолейкоз (СLL). При В-клеточном хроническом лимфолейкозе (СLL) отмечают пониженный уровень экспрессии генов miR-15a/miR-16-1 (и др.) в 13q14 участке хромосомы человека – сайте наиболее общих структурных аномалий (включая делеции участка в 30kb), хотя геном экспрессировал сотни зрелых и пре-miRNAs человека . Обе потенциально эффективные при терапии опухолей miRNAs содержали антисенс-участки антиапоптического белка Bcl2, подавляли его сверх-/экспрессию, стимулировали апоптоз, но почти/полностью отсутствовали в двух третях «отбившихся» от нормы CLL-клеток. Идентифицированы частые мутации секвенированных miRNAs в стволовых/соматических клетках у 11 из 75 пациентов (14.7%) с семейной предрасположенностью к CLL (способ наследования неизвестен), но не у 160 здоровых пациентов. Эти наблюдения вызывают предположение о прямом функционировании miRNAs в лейкемогенезе . В настоящее время не все известно о связи уровней экспрессии генов miRNAs (и их функций) и других генов в нормальных/опухолевых клетках .

Документ

Актуальность. Нарушение функции лицевого нерва при выполнении оперативного вмешательства на околоушной слюнной железе является одной из актуальных проблем и определяется как распространённостью заболевания, так и значительной частотой

Доусон черч - гений в ваших генах эпигенетическая медицина и новая биология намерения книга из библиотеки www e - puzzle ru книга из библиотеки www e - puzzle ru оглавление

Книга

Этика духовность онкология вич п гаряев* а энфи резюме

Документ

В настоящей статье отражён новый взгляд на проблему онкологии и ВИЧ-инфекции в свете Лингвистико-Волновой Генетики (ЛВГ) и Теории Сущностного Кодирования (ТСК) на материале российских и других социо-культурных реалий.

Онкологический научный центр и блохина одинцова анастасия сергеевна новые режимы химиотерапии распространенного и рецидивирующего рака шейки матки 14 01 12 – онкология

Диссертация

4.4. Определение гена изофермента уридинглюкоронилтрансферазы (UGT1A1) в сыворотке крови больных РШМ, получавших химиотерапию I линии иринотеканом с производными платины 105